Rho1D4是指牛视紫红质的细胞内C末端的最后9个氨基酸，它是由与该序列特异性结合的单克隆抗体而命名的。通过与Rho1D4抗体结合，此序列可作为一种高特异性的纯化标签用于膜蛋白的纯化。采用分子生物学方法将目的膜蛋白的C末端加上Rho1D4标签（图1），具有该序列的目的蛋白可被载有rho1D4抗体的亲和基质特异性结合，随后目的蛋白可通过添加过量的Rho1D4肽与基质抗体竞争性结合被洗脱下来，这种洗脱条件比改变pH更加温和。

 
图1：具有3个跨膜结构域的假设膜蛋白，将序列为TETSQVAPA的Rho-1D4标签添加至其C末端。

 
Rho1D4系统介绍
20世纪80年代首次对Rho1D4表位和抗体进行了表征，并通过将抗体与Sepharose®珠子偶联来纯化猴肾细胞中表达的牛视紫红质。此后，Rho1D4系统（标签，抗体偶联亲和基质，洗脱肽）被用于个别膜蛋白的研究，包括G蛋白偶联受体（GPCR），ATP结合转运蛋白，溶质反转运蛋白和四跨膜蛋白。该系统的一个优点是抗体-表位相互作用的高度特异性，而表位的序列和链长对于和抗体的结合是至关重要的。例如，用去除单个甲基的甘氨酸替代第三个丙氨酸可破坏二者的结合。同样，完整的9个氨基酸标签与Rho1D4抗体的结合紧密，去除2个氨基酸可破坏二者结合。因此，那些含有与Rho1D4表位相似序列的蛋白质的与抗体的非特异性结合可被降低，纯化到的蛋白都有较高的纯度（表格1）。

第1步：结合。将带Rho1D4标签的蛋白质与载有Rho1D4抗体的琼脂糖孵育，从裂解物中纯化目的蛋白。

第2步：洗涤。洗去杂蛋白和其他裂解物组分，只保留目的蛋白结合在亲和基质上。

第3步：洗脱。过量的Rho1D4肽竞争性地结合基质，靶蛋白被洗脱在洗脱液里。
 
Rho1D4系统的优点

Rho1D4系统的另一个优点是较高的目的蛋白回收率。包括细菌，酵母和哺乳动物细胞表达系统，已选择性的对一些GPCR和其他膜蛋白进行了优化。用Rho1D4系统纯化膜蛋白后可通过凝胶过滤层析或离心浓缩来除去洗脱肽。在所有表达系统中，蛋白质的产量都能达到毫克级别（表1）。纯化的蛋白质可用于功能研究，如配体结合的鉴定以及蛋白质间的相互作用。例如，将标记的ABCA4固定在装有Rho1D4抗体的基质上，以鉴定其对天然配体（即视网膜的加合物）的亲和力，然后通过添加ATP来释放。将CD81蛋白整体固定在涂有Rho1D4抗体的平板上，它表现出和分离可溶蛋白片段与丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的亲和结合力。另外还可通过SPR和放射性标记分析大麻素受体2（CB2）与配体结合，或将CB2重构进脂质体的进行G蛋白活化的测定。另外，有阴离子转运载体AE1结构域的重组蛋白被标记且用Rho1D4系统纯化后表现出与红细胞来源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。

表1.文献中报道的用rho1D4系统纯化的膜蛋白的纯度和产率的实例。尽管用Rho1D4系统纯化的许多蛋白质都是G蛋白偶联受体，但该系统也适用于纯化其他膜蛋白（如转运蛋白）。IAC：免疫亲和层析; IMAC：固定化金属亲和层析; SEC：分子排阻色谱。
 
Rho1D4系统入门

由于在异源宿主中表达时，不同的蛋白对于去垢剂及纯化柱的反应各不相同，所以在使用rho1D4系统纯化膜蛋白时需要对一些实验方法进行优化，那么找到所有必须的步骤并制定出优秀的实验方案显得尤为重要。以下4个步骤可帮助您快速有效地运用rho1D4系统纯化目的蛋白。如果需要我们帮助您进行优化，请与我们联系。
第一步，您的目标蛋白需要与Rho1D4标签融合，您可以将此标签带在目的蛋白C-或N-末端，建议选择对蛋白质活性影响很小的位置。
第二步，原核和真核系统在表达目的蛋白时具有不同的优势，需要进行反复试验筛选优秀的表达条件以找到合适的表达系统。在细菌系统（大肠杆菌）表达蛋白质需要对宿主，培养基，温度以及诱导时间的进行优化。
第三步，去垢剂用于溶解膜蛋白，选择优秀的去垢剂对目标蛋白后续的纯化至关重要。可对各种常用去垢剂进行筛选。
第四步，纯化Rho1D4标记的蛋白质时，需要与Rho1D4抗体偶联的亲和基质和竞争性洗脱用的Rho1D4肽。
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